un alto

Nature Communications volume 13, numero articolo: 2919 (2022) Citare questo articolo

9202 accessi

18 citazioni

21 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

I biosensori fluorescenti geneticamente codificati sono potenti strumenti utilizzati per tracciare i processi chimici nei sistemi biologici intatti. Tuttavia, lo sviluppo e l'ottimizzazione dei biosensori rimane un processo impegnativo e ad alta intensità di lavoro, principalmente a causa delle limitazioni tecniche dei metodi per lo screening dei biosensori candidati. Qui descriviamo una modalità di screening che combina la microfluidica delle goccioline e l'imaging automatizzato della fluorescenza per fornire un aumento di ordine di grandezza nella produttività dello screening. Inoltre, a differenza delle tecniche attuali che si limitano allo screening di una singola caratteristica del biosensore alla volta (ad esempio la luminosità), il nostro metodo consente la valutazione di più caratteristiche (ad esempio contrasto, affinità, specificità) in parallelo. Poiché le caratteristiche del biosensore possono variare, questa capacità è essenziale per una rapida ottimizzazione. Utilizziamo questo sistema per generare un biosensore ad alte prestazioni per il lattato che può essere utilizzato per quantificare le concentrazioni di lattato intracellulare. Questo biosensore, denominato LiLac, costituisce un progresso significativo nel rilevamento dei metaboliti e dimostra la potenza del nostro approccio di screening.

I biosensori fluorescenti geneticamente codificati sono strumenti importanti per lo studio del metabolismo. Il loro segnale fluorescente fornisce un'elevata risoluzione temporale, sia su scale temporali rapide che durante l'imaging cronico1,2,3,4,5 e, poiché sono geneticamente codificati, possono essere espressi direttamente nelle cellule viventi e mirati a specifici tipi di cellule e organelli6,7 . Poiché le singole cellule possono essere metabolicamente distinte e i metaboliti vengono scambiati a una velocità rapida8,9, i biosensori hanno consentito in modo univoco misurazioni precise in singole cellule degli stati metabolici di base e delle perturbazioni metaboliche in risposta a una sfida o uno stimolo1,10.

Per quantificare le concentrazioni di metaboliti, la lettura di un biosensore fluorescente deve essere i) sintonizzata sulle concentrazioni fisiologiche del ligando bersaglio, ii) altamente specifica per quel ligando e iii) resistente ai cambiamenti nell'ambiente cellulare (incluso il pH) e al livello di espressione del biosensore stesso. L'unico modo per sviluppare biosensori ad alte prestazioni è selezionarli, analizzando molte varianti individuali da grandi librerie di biosensori poiché sono esposte a molte concentrazioni e condizioni di ligandi.

Ciò rappresenta una sfida per lo screening dei biosensori. Nonostante gli impressionanti progressi nella progettazione di nuove piattaforme per l’evoluzione di proteine fluorescenti e biosensori7,11,12,13,14, gli screening esistenti sono ancora limitati nel numero di condizioni che possono essere testate rispetto al biosensore. Qui abbiamo superato queste limitazioni, aumentando il contenuto dello screening e la produttività per ordini di grandezza, combinando la microfluidica delle goccioline e l'imaging automatizzato della durata della fluorescenza a due fotoni (2p-FLIM). La durata della fluorescenza è il tempo medio tra l'assorbimento e l'emissione dei fotoni e i sensori della durata sono emersi come strumenti ad alte prestazioni per quantificare i livelli di piccole molecole nelle cellule intatte7,15,16. Qui abbiamo sfruttato gel semipermeabili prodotti microfluidicamente, chiamati sfere di gel-shell (GSB)17 che fungono da camere di dialisi su microscala e li abbiamo utilizzati per analizzare migliaia di varianti di sensori a vita isolate in modo indipendente rispetto a molte condizioni diverse, valutando contemporaneamente affinità, specificità e risposta misurare.

Mostriamo anche come il nostro sistema di screening, BeadScan, può essere utilizzato per sviluppare e ottimizzare rapidamente biosensori fluorescenti geneticamente codificati. A dimostrazione delle capacità del nostro schermo, abbiamo utilizzato BeadScan per generare un sensore ad alte prestazioni per il lattato, denominato LiLac. Il lattato è un prodotto chiave della glicolisi che è stato recentemente apprezzato come un importante combustibile cellulare che circola nel sangue, un mezzo per comunicare lo stato redox attraverso cellule e tessuti e un combustibile preferito per alcuni tipi di cancro18,19,20. I biosensori del lattato esistenti sono stati utilizzati per studiare il metabolismo nel cervello e nelle cellule tumorali21,22,23,24,25,26, ma ciascuno presenta limitazioni che rendono difficile la quantificazione (ad esempio debole sensibilità ai cambiamenti fisiologici del lattato o risposte indesiderate al calcio e/o pH). LiLac mostra un'ampia dimensione di risposta (cambiamento di vita di 1,2 ns e un cambiamento di intensità> 40% nelle cellule di mammifero), specificità per il [lattato] fisiologico e resistenza al calcio o ai cambiamenti del pH. Inoltre, la risposta della durata del LiLac è molto precisa e non richiede normalizzazione, facilitando la quantificazione delle concentrazioni di lattato nelle cellule viventi. Pertanto, LiLac costituisce un potente strumento per studiare il metabolismo a livello di singola cellula e dimostra i vantaggi del nostro approccio di screening.

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

Blog